辅助生殖技术与卵巢交界性肿瘤关系的研究进展

　　1 放射治疗与化学药物治疗对卵巢功能的影响

　　放射治疗与化学药物治疗（ 以下简称放化疗） 导 致卵泡耗竭、间质纤维化、血管损伤［3］，使得年轻癌症 女性早绝经的发病风险增高，患癌女童在性腺毒性治疗后会出现青春期延迟、原发性或继发性闭经［4］。放 化疗对卵巢功能的损伤程度取决于化疗方案和剂量， 放疗剂量和照射区域以及治疗前的卵巢储备功能［5］。 对于使用含有烷化剂（ 如环磷酰胺） 的化疗方案，造血 干细胞移植前的全身照射或卵巢直接照射的女性，其 卵泡耗竭程度最明显。Meirow［6］的研究显示，使用烷 化剂可致42%的女性出现卵巢早衰，其可能机制是烷 化剂经肝脏首过效应后的代谢产物可引起 DNA 双链 断裂，增生活跃的细胞对烷化剂最敏感，各种发育程 度的卵泡也受累［7］。卵巢受到放疗（ ≥5Gy） 或造血 干细胞移植前放疗后，早绝经风险增高 20 倍［8］。原 始卵泡体外培养显示，化疗药物可诱导凋亡机制，引 起卵泡结构紊乱以及前颗粒细胞肿胀［5］。放化疗后 女性出现闭经、潮热、盗汗等围绝经期症状，进而出现 心血管疾病、骨密度降低甚至骨质疏松，这将严重影 响癌症病人的生存质量［9］。因此，为癌症病人选择有 效化疗方案的同时，避免年轻病人的卵巢医源性损伤 也是医生应当考虑的内容。

　　2 女性生殖力保护方法

　　目前，女性生殖力保护的方法主要有： 卵母细胞 冻存、胚胎冻存和卵巢组织冻存，以及药物治疗和 手术［10］。

　　2. 1 卵母细胞冷冻

　　卵母细胞冻存包括成熟卵母细胞和未成熟卵母 细胞的冻存。一项 Meta 分析［11］显示，玻璃化冷冻方 法在卵子存活率、受精卵和胚胎质量方面可获得更好 的结果。成熟卵母细胞（ M Ⅱ期） 冻存是在放化疗前 进行控制性超促排卵获取成熟卵母细胞并进行冷冻， 在病人痊愈后解冻，通过体外受精 － 胚胎移植（ in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET） 受精获得胚 胎。癌症病人与非癌症病人卵母细胞解冻后的每例 胚胎移植活产率相似（ 44% vs 33%） ，说明卵母细胞 冻存对于育龄期癌症女性是一种安全有效的选 择［12］。需要注意的是，促排卵时机需根据女性的月 经周期而定，从确立癌症诊断到促排卵实施需要较长 时间，一项关于乳腺癌的 Meta 分析［13］显示，化疗开始 时间每延迟4 周，总体生存率即下降15%。促排卵过 程中所致的雌激素升高对于雌激素依赖性肿瘤（ 如乳 腺癌、卵巢癌等） 病人是否适用，也是选择成熟卵母细 胞冻存时医生应考虑的问题。Oktay 等［14］建议对乳 腺癌病人在放化疗前采用芳香化酶抑制剂（ 如来曲唑） 联合卵泡刺激素进行促排卵，但目前缺乏长期随 访的结果。 未成熟卵母细胞（ GV 期或 M I 期） 冷冻不需超促 排卵，不推迟放化疗开始时间，可从卵泡期、黄体期或 卵巢组织中获取，但与传统辅助生殖技术相比，卵母 细胞体外成熟的临床结局较低［15］。目前，通过未成 熟卵母细胞体外培养冻融后的活产案例鲜有报道。

　　2. 2 胚胎冷冻

　　胚胎冷冻技术已成为临床常规使用的生育力保 护方法，冷冻卵裂球期或囊胚期的胚胎较稳定，玻璃 化冷冻复苏率可达 90% 以上［16］，冻融周期的妊娠率 显著高于新鲜周期胚胎移植的妊娠率，这有可能是胚 胎和子宫内膜同步发育的结果［17］。尽管缺乏大型随 机对照研究评价胚胎冷冻对出生子代健康的影响，冻 胚移植仍被认为是安全可靠的［18］。胚胎冷冻能有效 减少促排卵治疗中的激素刺激，并提高累计妊娠率。 Ｒoy 等［19］的研究认为，与慢速冷冻法相比，玻璃化胚 胎冷冻能最大程度减小细胞损伤，提高复苏后存活 率。但该技术仅适用于已婚女性。与成熟卵母细胞 一样，胚胎冷冻也需卵巢刺激获取多个卵母细胞，标 准的促排卵方案从卵巢刺激到获取卵母细胞，大约需 要2 ～6 周的时间［20］，卵巢超促排卵过程中的高雌激 素暴露对乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等雌激素依赖 性肿瘤有可能产生不利影响。

　　2. 3 卵巢组织冻存与移植

　　1996 年 Hovatta 等［21］首次报道人卵巢组织冻存 成功。2004 年，第1 例经卵巢组织冻存及自体移植的 婴儿出生［22］。截至2016 年12 月底的数据，目前世界 范围内通过卵巢组织冻存及自体移植技术已成功诞 生86 名婴儿，另有 9 名婴儿即将出生［23］。与卵母细 胞冻存和胚胎冻存相比，一片卵巢组织可保存数百甚 至上千个不同发育等级的卵泡，生殖力储备丰富，日 后可用于自体移植或分离卵泡体外培养为成熟卵母 细胞，通过体外受精（ in vitro fertilization，IVF） 获得胚 胎［24］；不依赖于病人的生理周期，不需超促排卵，在 癌症确诊后可立即进行腹腔镜下卵巢组织取材，或在 癌症治疗开腹手术时取材，不推迟放化疗开始时 间［25］；无论病人婚否，均可进行卵巢组织冻存，是青 春期前女孩的唯一选择［26］； 不仅能够有效保存病人 生育力，还能在一定程度上恢复卵巢的内分泌功能。 基于这些优势，卵巢组织冻存与移植具有广阔的应用 前景。

　　2. 3. 1 卵巢组织冻存的适应人群

　　年龄是卵巢组织冻存需考虑的重要因素，女性在 35 岁以后，卵巢储备功能随年龄下降，年龄大于38 岁 的女性不建议进行卵巢组织冻存。许多中心将卵巢 组织冻存年龄上限定为35 岁［27］。 Donnez 等［27］认为，寻求卵巢组织冻存的因素可 分为癌症、良性疾病和社会因素3 大类，具体如下： 1） 癌症： ①系统性疾病，包括霍奇金淋巴瘤、非霍 奇金淋巴瘤、白血病、成神经管细胞瘤； ②盆腔外疾 病，包括骨肿瘤（ 骨肉瘤、尤文肉瘤） 、乳腺癌、黑色素 瘤、神经母细胞瘤、肠道恶性肿瘤； ③盆腔疾病，包括 盆腔肉瘤、横纹肌肉瘤、骶骨肿瘤、直肠乙状结肠癌、 早期宫颈癌、早期阴道癌、早期外阴癌、卵巢癌早期（ I A 期） 、卵巢交界性肿瘤。 2） 良性疾病： ①单侧或双侧卵巢切除，原因包括 良性卵巢肿瘤、严重或复发性子宫内膜异位症、 BＲCA1 或 BＲCA2 基因突变携带者； ②具有早绝经风 险的疾病，包括特纳综合征、早绝经家族史、需化疗的 良性疾病（ 系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、贝赛特氏 症、Wegener’ s 肉芽肿病） ; ③需骨髓移植的疾病，包 括良性血液病（ 镰状细胞贫血、重症地中海贫血、再生 障碍性贫血） 、对免疫抑制剂不应答的自身免疫性 疾病。 3） 社会因素： 年龄因素、因社会或经济因素推迟 生育的病人。 需要注意的是，白血病病人的卵巢组织中可能存 在恶性白血病细胞。Delmarn 等［28］对比利时某卵巢 组织冻存库 15 年的数据进行了分析，发现 391 名癌 症病人的卵巢组织中，13%在光学显微镜下发现卵巢 组织中有癌细胞转移，白血病病人的卵巢组织移植片 中恶性白血病细胞的风险最高。Dolmans 等［29］采用 反转录酶 －聚合酶链锁反应（ reverse transcription-polymerase chain reaction，ＲT-PCＲ） 技术发现50%的白血 病病人中恶性细胞阳性，而在白血病完全缓解后取材 的卵巢组织并未发现恶性白血病细胞［30］，因此，在第 一次缓解后和骨髓移植前进行卵巢组织取材可有效 降低移植的风险。尽管目前未发生移植后癌症复 发［24］，但严格的监测方法，应用组织学、免疫组织化 学以及 ＲT-PCＲ、荧光原位杂交等方法以避免癌细胞 的入侵、肿瘤复发和播散是保障卵巢组织移植后安全 性的关键［31］。 对于白血病、Burkitt 淋巴瘤、神经母细胞瘤等移植高风险的疾病［32］，从卵巢组织中分离第一次减数 分裂前期双线期（ G V 期） 或第一次减数分裂中期（ M I 期） 的卵母细胞体外培养至第二次减数分裂中期（ M Ⅱ期） 的成熟卵母细胞，可以有效避免卵巢组织移植 后肿瘤复发的风险［33］。未成熟卵泡体外培养对环境 要求较高，技术复杂，需要动态、多步的培养环境以配 合卵泡发育不同阶段，维持卵母细胞与体细胞（ 即颗 粒细胞） 的相互联系［34］。目前只有动物实验能够通 过该技术实现子代出生［35］，Xiao 等［36］通过两步培养 法首次将人类窦前卵泡体外培养至 M Ⅱ期。

　　2. 3. 2 卵巢组织冻存方法

　　卵巢组织冻存是在低温条件下使卵巢组织细胞 降温、脱水和非损伤性冰晶形成，进而使各种分子运 动速度减慢、停止，细胞代谢率降低，处于休眠状态。 目前广泛使用的冻存方法根据冻存速度的不同分为 快速冷冻和慢速冷冻（ slow freezing） 。快速冷冻又称 玻璃化冷冻（ vitrification） ，使用高浓度的冷冻保护剂 （ cryoprotective agent，CPA） 逐步渗透和梯度洗脱的方 法，经快速降温后，使物质由液态直接转化为非晶体 玻璃化状态或无定形态，胞质内外的水物质在超过1 500 ℃ /min 的降温速度下，迅速通过5 ～15 ℃的冷冻 敏感区，可最大限度避免细胞内冰晶形成，减轻冰晶 形成所造成的挤压损伤和冻融效应，降低细胞损 伤［37］。慢速冷冻又称程序化冷冻，是一种传统冷冻 方法，采用较低浓度的冷冻保护剂在程序化冷冻仪的 控制下缓慢降温使细胞充分脱水，直至进入液氮。方 法成熟、效果稳定，由于降温速度慢，适合体积相对较 大的卵巢组织块。 目前哪种方法更有利于保存卵巢组织存在争议。 有研究［38-39］认为慢速程序化冷冻需要的 CPA 浓度较 低，对细胞毒性相对较小，CPA 可在冻存前和冻存过 程中缓慢均匀地渗入整个组织，可有效保存细胞活 性；也有研究认为，玻璃化冷冻使细胞内外的水物质 转化为介于固、液态之间且粘度高的非晶体“玻璃化” 状态，减少对细胞结构的损伤，在保存次级卵泡形态 和卵巢基质细胞方面更有优势［40-41］。研究［39，42-43］显 示，二者在维持形态学完整性（ 原始和初级卵泡形 态） ，体外培养雌激素释放量，以及冻存后卵泡增生/ 凋亡比率方面相似。值得注意的是，目前各中心采用 玻璃化冷冻的 CPA 浓度、种类差别较大，冷冻载体也 不尽相同，因此，许多中心将玻璃化冷冻与慢速冷冻 比较得出不同的结论，不排除此原因。此外，玻璃化冷冻的卵巢组织复苏后有被液氮中微生物污染的风 险，安全性也是该冷冻技术未来应用中需要克服的问 题。根据现有报道［23］，世界范围内通过卵巢组织冻存技术出生的 86 名婴儿中，只有 2 名经玻璃化冷冻 技术诞生。因此，这 2 种方法的优劣仍有待研究，二 者的比较见表1。

　　表1 程序化冷冻与玻璃化冷冻的比较

　　2. 3. 3 卵巢组织移植

　　卵巢组织的移植分为原位移植和异位移植，原位 移植包括卵巢髓质、子宫阔韧带、卵巢囊或腹膜窗等， 异位移植多选择腹壁、前臂、腹直肌等［44］。原位移植 的优点在于更靠近输卵管，所以只有原位移植有自然 怀孕的可能；缺点是如果移植部位选择卵巢髓质或卵 巢囊，移植片数量受卵巢体积的限制，且原位移植需 进行侵入性操作［45］。理论上讲，由于卵泡发育对温 度、压力、血供和旁分泌等有严格的要求，与异位移植 相比，盆腔及腹膜内环境（ 腹膜液及特殊的氧化作用） 能够为卵泡发育提供更好的环境［24］。但在一项研 究［46］中， 5 名将卵巢组织异位移植到腹直肌或腹直肌 鞘的女性，内分泌功能在移植后3 ～ 5 个月均得以有 效恢复。异位移植的优点在于： ①避免了侵入性操 作； ②易获取卵泡； ③再移植成本较低； ④如因放疗或 手术后出现严重盆腔粘连而不适合移植时，可进行异 位移植［46］，但需通过 IVF 技术才能妊娠。 卵巢功能的恢复可通过雌二醇水平的升高和促 性腺激素水平降低来判定，超声下检测到黄体可证实 有排卵［44］。研究［24］报道的卵巢组织自体移植后恢复 卵巢功能的时间不一，多数为 2. 0 ～ 6. 5 个月不等。 采用程序化冷冻后复苏的卵巢组织块，无论较大［如 （ 8 ～10） mm × 5 mm］或较小的组织块（ 如 2 mm × 2 mm） 均能有效恢复卵巢的内分泌功能［47］。每次移 植后的妊娠率约为27% ～33%［47-49］，这些妊娠妇女中 自然怀孕率高达50% ～91%［49-50］。 影响移植后卵巢寿命的因素有： ①卵巢储备功能 （ 卵泡密度，取决于年龄） ; ②冻存前化疗； ③移植组织片体积和卵巢组织准备方法（ 冷冻 －复苏技术） ; ④移 植的皮质片中卵泡分布； ⑤移植部位的血管形成能 力，影响移植后缺血程度［24］。

　　2. 4 药物治疗

　　主要指在放化疗前注射促性腺激素释放激素激 动剂（ gonadotropin-releasing hormone agonist，GnＲHa） 抑制卵巢功能，首次应用于 30 多年前。其可能涉及 的机制有降低原始卵泡活性、减少低刺激素状态下的 卵巢血流灌注、减少卵巢凋亡或通过 GnＲH 激活化疗 中的抗凋亡途径［51］。但GnＲHa 能否有效保护卵巢功 能，各方观点不一。Turner 等［52］对 12 项试验结果分 析指出，GnＲHa 在保护年轻乳腺癌病人卵巢功能方面 效果并不确切。体外研究［51］显示GnＲHa 对放化疗造 成的卵巢功能损伤无任何保护作用。而一项 Meta 分 析［53］显示，化疗期间采用 GnＲHa 短暂抑制卵巢功能 能够降低卵巢早衰风险。出现上述争议可能是病人 的人口学特征、化疗方案、随访时间、研究终点等不同 所致。2013 年美国临床肿瘤学会（ American Society of Clinical Oncology，ASCO） 指南［18］指出，GnＲHa 在生殖 力保护方面的证据并不充分，但也许可以产生其他益 处，如减少化疗所致血小板降低时的阴道出血。因 此，GnＲHa 在保护卵巢功能方面的效果仍值得探究。

　　2. 5 卵巢移位

　　卵巢移位一般在腹腔镜下即可完成，在盆腔照射 前将卵巢固定在距盆腔较远的位置，但不改变其与输 卵管的位置关系，通常选择腹前外侧壁，脐上 3 ～ 5 cm。但该手术对卵巢功能的保护作用很有限，经卵巢 悬吊的女性在盆腔放疗后发生卵巢早衰的风险曾有报道达15% ～ 40%［27］，但现在越来越多的临床实践 证明，基本没有保护作用。2013 年 ASCO 指南［18］建 议育龄期女性在盆腔放疗前可行卵巢移位手术以保 护卵巢功能，但由于放射线比较分散，应告知病人该 技术并非能够成功有效地保护卵巢功能。

　　3 小结与展望

　　近年来由于患癌人群的逐年增长，肿瘤生殖学也 越来越受到人们的关注。2013 年 ASCO 指南［18］建 议，“医疗工作人员（ 包括妇科肿瘤、儿科肿瘤、血液科 医生等） 进行知情同意的过程中，应当向即将采取性 腺毒性治疗的病人告知其治疗不孕的可能性，并为他 们提供生殖力保护的建议指导，为她们选取合适的生 殖医学专家”。重视肿瘤病人的生殖力保护，对提高 其病愈后的生活质量，给予她们生活的勇气，具有重 要的意义。卵母细胞冻存、胚胎冻存均可以满足病人 未来的生育要求，但如前所述，具有一定的局限性； GnＲHa 和卵巢悬吊手术在保护卵巢功能方面效果并 不明确；卵巢组织冻存除解决病人癌症痊愈后的生育 要求外，还能够恢复卵巢的内分泌功能，对于治疗时 间紧迫或不能接受超促排卵的病人，是最佳的生殖力 保护选择，也是青春期前癌症生存者的唯一选择。现 有的研究［54］有足够的证据表明，卵巢组织冻存及移 植技术，是应该从实验阶段快速发展到临床实践的时 候了，此技术具有广阔的应用前景，是保护女性生育 力的理想选择。

　　参考文献略。